A. Pendahuluan
Dewasa ini metode sekuensing
Maxam-Gilbert sudah sangat jarang digunakan karena ada metode lain yang jauh
lebih praktis, yaitu metode dideoksi yang dikembangkan oleh A. Sanger dan
kawan-kawan pada tahun 1977
Sanger sequencing merupakan metode sekuensing DNA
berdasarkan penggabungan selektif rantai-terminating dideoksi oleh polimerase DNA selama in vitro replikasi DNA . [1] [2]
Dikembangkan oleh Frederick Sanger dan rekan pada tahun 1977, itu adalah metode
yang paling banyak digunakan sekuensing selama kurang lebih 25 tahun.
Sekuensing
DNA teknikSangermembutuhkan:
1.
DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA
2.
Primer yang sesuai (sepotongkecil DNA yang
berpasangan dengan template DNA danberfungsisebagaistarting point untukreplikasi
3.
DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA,
menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 daritemplate
4.
Sejumlahnukeotida normal
5.
Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel
(radioaktif atau dengan pewarna fluorescent)
Sampel DNA
dibagi menjadi empat reaksi sequencing
yang terpisah, yang berisi semua empat dari deoksinukleotida
standar(dATP, dGTP, dCTPdandTTP) dan DNA polimerase.Untuk setiap reaksi ditambahkan
hanya satu dari keempat dideoksinukleotida
(ddATP, ddGTP, ddCTP, atauddTTP).
B. Sekuensing DNA denganteknik Sanger
Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah
satu subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat
tersebut adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan
ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP hanya
kehilangan gugushidroksil (OH) pada
atom C nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga
mengalami kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat
membentuk ikatan fosfodiester.
Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut
tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini
dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP.
Dengan dasar pemikiran itu sekuensing DNA menggunakan metode
dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi
dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-masing
reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi akan
terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi,
di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya
bervariasi tetapi ujung 3’nya selalu berakhir dengan basa yang sama. Sebagai
contoh, dalam reaksi yang mengandung ddATP akan diperoleh fragmen-fragmen DNA
dengan berbagai ukuran yang semuanya mempunyai basa A pada ujung 3’nya.
Secara umum Sekuensing
DNA dengan teknik sanger adalah sebagai berikut:
1.
Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal
tetapi secara random dideoxy (DD) nukleotida diambil (dipasangkan).
2.
Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan reaksi berhenti
3.
Hasilnya DNA dengan panjang yang bervariasi
,masing-masing berhenti pada DDnukleotida tertentu yang dilabel.
4.
Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan
yang berbeda selama elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan.
DAFTAR PUSTAKA
Allison, L.A. (2007).
Fundamental Molecular Biology. Malden, MA: Blackwell Publishing
-2.jpg)