Sekuensing DNA Teknik Sanger

A.    Pendahuluan

Dewasa ini metode sekuensing Maxam-Gilbert sudah sangat jarang digunakan karena ada metode lain yang jauh lebih praktis, yaitu metode dideoksi yang dikembangkan oleh A. Sanger dan kawan-kawan pada tahun 1977

Sanger sequencing merupakan metode sekuensing DNA berdasarkan penggabungan selektif rantai-terminating dideoksi oleh polimerase DNA selama in vitro replikasi DNA . [1] [2] Dikembangkan oleh Frederick Sanger dan rekan pada tahun 1977, itu adalah metode yang paling banyak digunakan sekuensing selama kurang lebih 25 tahun.

Sekuensing DNA teknikSangermembutuhkan:

1.      DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA

2.      Primer yang sesuai (sepotongkecil DNA yang berpasangan dengan template DNA danberfungsisebagaistarting point untukreplikasi

3.      DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 daritemplate

4.      Sejumlahnukeotida normal

5.      Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna fluorescent)

Sampel DNA dibagi menjadi empat reaksi sequencing yang terpisah, yang berisi semua empat dari deoksinukleotida standar(dATP, dGTP, dCTPdandTTP) dan DNA polimerase.Untuk setiap reaksi ditambahkan hanya satu dari keempat dideoksinukleotida (ddATP, ddGTP, ddCTP, atauddTTP).

B.     Sekuensing DNA denganteknik Sanger

Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugushidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP.

Dengan dasar pemikiran itu sekuensing DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi akan terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi tetapi ujung 3’nya selalu berakhir dengan basa yang sama. Sebagai contoh, dalam reaksi yang mengandung ddATP akan diperoleh fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran yang semuanya mempunyai basa A pada ujung 3’nya. 

Secara umum Sekuensing DNA dengan teknik sanger adalah sebagai berikut:

1.      Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal tetapi secara random dideoxy (DD) nukleotida diambil (dipasangkan).

2.      Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan reaksi berhenti

3.      Hasilnya DNA dengan panjang yang bervariasi ,masing-masing berhenti pada DDnukleotida tertentu yang dilabel.

4.      Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang berbeda selama elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan.

DAFTAR PUSTAKA

Allison, L.A. (2007). Fundamental Molecular Biology. Malden, MA: Blackwell Publishing

http://en.wikipedia.org/wiki/Sanger_sequencing

Ibrahim Essam H. Biotechnology Course. Egypt: Biology Depatment, Faculty of Science King Khalid University.